染料法PCR試劑盒的使用前準(zhǔn)備工作你知道嗎？
點(diǎn)擊次數(shù)：623 更新時(shí)間：2019-11-25
染料法PCR試劑盒的使用前準(zhǔn)備工作你知道嗎？
在常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)中，染料法PCR試劑盒測(cè)定過(guò)程為試劑準(zhǔn)備工作，加樣，洗滌，保溫等正常的實(shí)驗(yàn)流程，一次好的準(zhǔn)備工作可以使測(cè)定中試劑發(fā)揮大的作用，也可以因?yàn)橐粋€(gè)小步驟而發(fā)生多種測(cè)定結(jié)果。那么在實(shí)際檢測(cè)前，用戶都需要做哪些準(zhǔn)備工作呢？
1、加樣
在染料法PCR試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在染料法PCR試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定(如間接法染料法PCR試劑盒)需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。
2、試劑盒準(zhǔn)備
按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。染料法PCR試劑盒中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。
3、保溫
在染料法PCR試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱為溫育，有人稱之為孵育，在染料法PCR試劑盒中似不恰當(dāng)。染料法PCR試劑盒屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。
4、洗滌
洗滌在染料法PCR試劑盒過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。可以說(shuō)在染料法PCR試劑盒操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。洗滌的方式除某些染料法PCR試劑盒儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種
5、顯色和比色
(1) 顯色
顯色是染料法PCR試劑盒中的后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。
(2 )比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。
